Tóm tắt
Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một hội chứng phát triển thần kinh lan tỏa với gánh nặng lớn về mặt kinh tế và con người. Sinh lý bệnh của ASD phần lớn vẫn chưa rõ ràng, do đó cản trở việc phát triển các phương pháp điều trị dược lý cho các triệu chứng cốt lõi của rối loạn. Người ta đưa ra giả thuyết rằng những bất thường trong tín hiệu glutamate và GABA là nguyên nhân gây ra các triệu chứng ASD và có thể hình thành mục tiêu điều trị, nhưng không biết liệu những bất thường này có được tái hiện ở người mắc ASD hay không, cũng như ở các mô hình động vật gặm nhấm mắc chứng rối loạn này. Chúng tôi đã sử dụng phổ cộng hưởng từ proton tịnh tiến ([1H]MRS) để so sánh nồng độ glutamate và GABA ở người trưởng thành mắc ASD và trong một nhóm gồm sáu mô hình ASD ở động vật gặm nhấm khác nhau, bao gồm các nguyên nhân di truyền và môi trường. [1H]MRS được thực hiện ở thể vân và vỏ não trước trán giữa của người, chuột và chuột cống để cho phép so sánh trực tiếp giữa các loài ở các vùng não vỏ não và dưới vỏ não cụ thể liên quan đến ASD. Ở những người mắc ASD, nồng độ glutamate giảm ở thể vân và điều này có liên quan đến mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng xã hội. Nồng độ GABA không thay đổi ở bất kỳ vùng não nào. Sự giảm glutamate ở thể vân được tóm tắt lại ở những con chuột tiếp xúc với valproate trước khi sinh và ở những con chuột và chuột cống mang đột biến Nlgn3, nhưng không có ở các mô hình ASD ở loài gặm nhấm có nguyên nhân khác. Những phát hiện của chúng tôi cho thấy rằng những bất thường về glutamate/GABA trong mạch vỏ não-thể vân có thể là một cơ chế bệnh lý chính ở ASD; và có thể liên quan đến những thay đổi trong phức hợp tín hiệu neuroligin-neurexin
Giới thiệu
Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là một hội chứng phát triển thần kinh lan tỏa đặc trưng bởi những khiếm khuyết trong sự tương hỗ xã hội và giao tiếp, và bởi những sở thích hạn chế và hành vi lặp đi lặp lại (DSM-5)1. ASD ảnh hưởng đến 1–2% dân số và phổ biến hơn ở nam giới gấp năm lần so với nữ giới2. Gánh nặng xã hội cao của ASD trở nên trầm trọng hơn do thực tế là không có phương pháp điều trị dược lý hiệu quả nào cho các triệu chứng cốt lõi của rối loạn này. Nguyên nhân chủ yếu là do nguyên nhân và bệnh sinh của ASD phần lớn không rõ ràng, do đó dẫn đến việc thiếu các mục tiêu điều trị. Hầu hết ASD các trường hợp này là vô căn, nghĩa là không thể quy cho bất kỳ nguyên nhân bệnh sinh nào đã biết3, và trong khi các yếu tố rủi ro về di truyền và môi trường gây ra một số trường hợp ASD đã được xác định, thì các cơ chế thần kinh liên quan vẫn chưa chắc chắn.
Tuy nhiên, bằng chứng mới nổi cho thấy rằng những bất thường trong sự cân bằng giữa dẫn truyền thần kinh kích thích (qua trung gian glutamate) và ức chế (qua trung gian GABA) có thể là một cơ chế bệnh sinh phổ biến và do đó là một mục tiêu điều trị trong ASD4–6. Ví dụ, những bất thường trong biểu hiện của thụ thể glutamate và GABA đã được quan sát thấy trong não sau khi chết của những người mắc ASD7. Trong cơ thể sống, phổ cộng hưởng từ proton ([1H]MRS) đã phát hiện ra những thay đổi về mức độ glutamate và glutamine trong vỏ não và hạch nền của trẻ em, và trong hạch nền ở người lớn mắc ASD8–16. Hơn nữa, tình trạng giảm GABA đã được báo cáo ở một số vùng não ở trẻ em mắc ASD13,17–20. Mặc dù các nghiên cứu này phù hợp với và hỗ trợ cho giả thuyết về sự mất cân bằng kích thích/ức chế (E/I) trong ASD, nhưng những phát hiện tương ứng của chúng không phải lúc nào cũng đồng tình về mặt hướng mất cân bằng và cơ chế sinh học cơ bản vẫn chưa được hiểu rõ7–20. Tuy nhiên, có thể đạt được tiến triển với sự trợ giúp của các mô hình gặm nhấm của ASD. Các mô hình này bao gồm nhiều nguyên nhân khác nhau bao gồm di truyền, nhiễm sắc thể, tức là, các biến thể số bản sao (CNV) và các tác động của môi trường21. Điều này cung cấp một hộp công cụ mạnh mẽ để khám phá nền tảng của sự mất cân bằng E/I trong ASD. Các cuộc điều tra điện sinh lý và sinh hóa trong các mô hình động vật của ASD đã phát hiện ra sự mất cân bằng cụ thể theo vùng não và mô hình trong chức năng E/I6,22–26, nhưng vẫn khó liên hệ những phát hiện này với ASD ở người do bản chất xâm lấn của các kỹ thuật, ví dụ như ghi lát não, thường được sử dụng. Ngược lại, [1H]MRS không xâm lấn và có thể được sử dụng an toàn ở người và động vật như nhau—do đó cho phép so sánh trực tiếp giữa các loài. Tuy nhiên, hiện tại vẫn chưa có các cuộc điều tra [1H]MRS tương đương về glutamate và GABA ở cả người và mô hình gặm nhấm của ASD.
Do đó, để xác định xem ASD có liên quan đến mức độ bất thường của glutamate và GABA trong cơ thể sống hay không, và để khám phá cơ sở sinh học được cho là của nó, chúng tôi đã tiến hành một nghiên cứu [1H]MRS dịch mã ở cả người mắc ASD vô căn và một nhóm mô hình gặm nhấm mắc ASD. Chúng tôi đã chọn sáu mô hình đa dạng về nguyên nhân để bao gồm nhiều yếu tố nguy cơ đã xác định trước đó đối với ASD không phải hội chứng ở người, cụ thể là (1) tiếp xúc trước khi sinh với valproate (axit valproic, VPA), một yếu tố nguy cơ môi trường đối với ASD27, (2) sự nhân đôi vùng nhiễm sắc thể 15q11-13 của cha, CNV28–31 liên quan đến ASD thường gặp nhất và (3) ba mô hình đơn gen mang đột biến ở các gen liên quan đến khớp thần kinh có liên quan đến ASD ở người: chuột loại bỏ gen Shank3 (KO)26,32, chuột loại bỏ gen Nlgn3R451C (KI) và chuột Nlgn3 KO, cả hai đều có đột biến ở cùng một gen, do đó cho phép so sánh giữa hai loài gặm nhấm25,33. Ngoài ra, một dòng chuột cận huyết, chuột BTBR T+tf/J34, có giá trị bề ngoài mạnh nhưng chưa rõ về mặt di truyền đã được sử dụng làm mô hình của ASD có nguồn gốc đa gen được cho là. Chúng tôi đã thực hiện [1H]MRS ở cùng một vùng não giữa người, chuột và chuột cống để cho phép so sánh trực tiếp giữa các loài. Chúng tôi đã chọn tập trung vào hai vùng não trước đây có liên quan đến cả bệnh lý ASD và hành vi xã hội ở những cá nhân không mắc ASD, cụ thể là vùng vân não và vỏ não trước trán giữa (mPFC)6,11,35–37.
Vật liệu và phương pháp
Người tham gia là con người
Tổng cộng 25 cá nhân mắc chứng ASD vô căn đã được tuyển dụng từ Phòng khám di truyền hành vi tại Bệnh viện Maudsley, một dịch vụ giới thiệu quốc gia để chẩn đoán các rối loạn phát triển thần kinh. Những người tham gia đối chứng được tuyển dụng thông qua các quảng cáo tại địa phương.
Tiêu chí tuyển chọn đối với tất cả người tham gia bao gồm: (1) IQ toàn diện ≥80; (2) hiện không dùng bất kỳ loại thuốc hướng thần nào và không dùng thuốc hướng thần trong ít nhất sáu tuần qua; (3) không có tiền sử động kinh, chấn thương đầu, bệnh não hoặc nhiễm trùng hoặc bệnh lý nghiêm trọng (theo tự báo cáo); (4) không có tiền sử rối loạn lưỡng cực, tâm thần phân liệt hoặc nghiện ma túy hoặc rượu; (5) không có chống chỉ định chụp MRI, tức là không có cấy ghép kim loại, máy tạo nhịp tim hoặc tiền sử phẫu thuật lớn ở đầu hoặc ngực. Những người tham gia nhóm ASD được yêu cầu đáp ứng các tiêu chí nghiên cứu của Phân loại bệnh quốc tế – Phiên bản 10 (ICD-10) về chứng tự kỷ. Tất cả các chẩn đoán đều được xác nhận bằng Lịch trình quan sát chẩn đoán tự kỷ (ADOS-G) và nếu có thể, cũng bằng Phỏng vấn chẩn đoán tự kỷ – Phiên bản sửa đổi. Tóm tắt về đặc điểm nhân khẩu học của những người tham gia được tuyển dụng được đưa ra trong Bảng 1. Hai nhóm không khác nhau về độ tuổi, giới tính hoặc IQ toàn diện, IQ bằng lời nói hoặc IQ hiệu suất khi được đánh giá bằng Thang đo trí thông minh rút gọn Wechsler. Sự chấp thuận về mặt đạo đức cho nghiên cứu này đã được Ủy ban đạo đức nghiên cứu quốc gia Essex 2 cung cấp (tham chiếu 04Q0102/26). Sự đồng ý đầy đủ bằng văn bản theo Tuyên bố Helsinki đã được lấy từ tất cả những người tham gia.
[1H]MRS của con người: thu thập và xử lý dữ liệu
Vân não (bao gồm phần đầu của nhân đuôi, nhân trước và vỏ não trong) và mPFC đã được chọn làm vùng quan tâm (ROI) trên cơ sở các nghiên cứu về bệnh lý thần kinh và MRI đã liên kết các vùng não này với ASD6,11,35–37 và chúng tôi đã chứng minh được sự giảm Glx (nhóm kết hợp của glutamate, glutamine và glutathione) ở vân não trước đó11. Vì những cân nhắc thực tế giới hạn chúng tôi ở một ROI vân đơn phương, chúng tôi đã chọn vân trái để duy trì khả năng tương thích tối đa với nghiên cứu trước đây của chúng tôi11. Hơn nữa, các nghiên cứu trước đó đã báo cáo sự độc lập của mức độ chất chuyển hóa với tính bên của ROI38–40. Đối với
Bảng 1 Tóm tắt các đặc điểm nhân khẩu học và lâm sàng của những người tham gia
| Đặc điểm lâm sàng | Nhóm đối chứng n=25 (mean ± SEM) | Nhóm ASD n=25 (mean ± SEM) | ASD và đối chứng |
| Độ tuổi (năm) | 28,91 ± 1,40 | 30,98 ± 1,81 | 0,36 |
| IQ ngôn ngữ | 117,29 ± 1,91 | 115,05 ± 3,31 | 0,53 |
| IQ hiệu suất | 115,32 ± 2,26 | 114,32 ± 3,74 | 0,81 |
| IQ toàn diện | 118,66 ± 4,07 | 114,23 ± 3,19 | 0,23 |
| Tương tác xã hội ADI-R | NA | 16,11±1,26 | NA |
| Giao tiếp ADI-R | NA | 12,58 ± 1,56 | NA |
| ADI-R lặp lại | NA | 7,73 ±0,46 | NA |
| Tương tác xã hội ADOS-G | NA | 4,00 ± 0,36 | NA |
| Giao tiếp ADOS-G | NA | 4,00 ± 0,36 | NA |
Nhóm đối chứng không được đánh giá ADI-R hoặc ADOS-G. Để tham khảo, các ngưỡng được chấp nhận rộng rãi để chẩn đoán ASD là: ADI-R: ≥10 (tương tác xã hội), ≥8 (giao tiếp), ≥3 (hành vi lặp đi lặp lại); ADOS-G: ≥4 (tương tác xã hội), ≥2 (giao tiếp), ≥7 (tương tác xã hội và giao tiếp kết hợp). Dữ liệu được mô tả là giá trị trung bình ± SEM; kiểm định t hai đuôi
ADI-R Phỏng vấn chẩn đoán tự kỷ-Sửa đổi, ADOS-G Lịch trình quan sát chẩn đoán tự kỷ, Rối loạn phổ tự kỷ ASD, Chỉ số thông minh IQ, NA không áp dụng
ROI vỏ não, mPFC song phương bao gồm hồi vành đai đã được chọn. Hình bổ sung 1a mô tả các ví dụ về vị trí ROI. [1H]Dữ liệu MRS đã được thu thập trên máy quét MRI HDxt 3T GE (GE Medical Systems, Milwaukee, WI, Hoa Kỳ). Quét MRI cấu trúc để định vị ROI tiếp theo và phân đoạn mô đã được thu thập bằng cách sử dụng thu thập hồi âm gradient chuẩn bị đảo ngược-phục hồi nhanh 3D (thời gian đảo ngược (TI) = 450 ms, thời gian lặp lại (TR) = 7 ms, thời gian hồi âm (TE) = 2,8 ms, ma trận = 256 × 256 × 124 với kích thước voxel 0,9375 × 0,9375 × 1,1 mm3). Phổ [1H]MRS đã được thu thập bằng cách sử dụng Phổ học phân giải điểm Meshcher–Garwood (MEGAPRESS). MEGAPRESS là một kỹ thuật chỉnh sửa phổ được sử dụng rộng rãi cho phép định lượng GABA ở người ở cường độ từ trường mà GABA không dễ dàng phát hiện được khi chỉ sử dụng phương pháp quang phổ phân giải điểm thông thường (PRESS)41. Các xung kích thích và hội tụ lại được dịch chuyển 2 ppm lên phía trên mặt nước, sao cho vị trí của voxel là chính xác đối với các chất chuyển hóa nằm ở trung tâm của quang phổ và để giảm thiểu các dịch chuyển dịch chuyển hóa học trong quá trình lựa chọn thể tích cho phạm vi chất chuyển hóa quan tâm. Glutamate và glutamine được ước tính từ quang phổ MEGAPRESS “chưa chỉnh sửa” (tương đương với quang phổ PRESS), vì trong quang phổ “đã chỉnh sửa” xảy ra đồng chỉnh sửa với GABA42. GABA được định lượng từ quang phổ “khác biệt” (đã chỉnh sửa-chưa chỉnh sửa). Một ROI (35 × 30 × 25 mm) được đặt ở thể vân não trái. Một ROI thứ hai (25 × 40 × 30 mm) được đặt trên mPFC. Các tham số thu thập là: TR = 2000 ms, TE = 68 ms và tổng cộng 368 giá trị trung bình cho mỗi ROI: 176 chỉnh sửa, 176 chỉnh sửa tắt và 16 với nước không bị ức chế để tạo tỷ lệ nước. Phổ [1H]MRS được xử lý bằng phần mềm LCModel (phiên bản 6.3-0I; http://s-provencher.com/lcmodel.shtml). Tỷ lệ nước được thực hiện bởi LCModel, tức là, mỗi đỉnh chất chuyển hóa được chuẩn hóa bằng cách thể hiện độ lớn của nó dưới dạng tỷ lệ so với độ lớn của đỉnh nước không bị ức chế. Các ước tính theo tỷ lệ nước có thể so sánh được giữa các ROI và giữa những người tham gia và được thể hiện bằng các đơn vị thể chế như đã mô tả trước đây11. Phổ được kiểm tra trực quan và các thông số kiểm soát chất lượng LCModel được xem xét để xác minh rằng phổ không bất thường về mặt chất lượng: tất cả các tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu đều ≥14 (vân não: 20,70 ± 3,35; mPFC: 21,10 ± 3,76) và tất cả các độ rộng đầy đủ ở một nửa cực đại đều ≤0,11 ppm (vân não: 0,07 ± 0,015 ppm; mPFC: 0,05 ± 0,022 ppm). Phổ không phù hợp với giới hạn dưới Cramer–Rao bằng hoặc cao hơn 20% ước tính chuyển hóa đối với glutamate, glutamine hoặc GABA đã bị loại khỏi phân tích tiếp theo; điều này dẫn đến việc loại trừ một ước tính Glx và một GABA khỏi ROI mPFC của một người tham gia trong nhóm đối chứng. Chất lượng của phổ [1H]MRS thu được được thể hiện trong Hình bổ sung 1b–d.
Để kiểm soát sự khác biệt giữa các cá thể trong thành phần mô ROI, một quy trình chia tỷ lệ đã được sử dụng, như đã mô tả trước đây11. Tóm lại, MRI cấu trúc đầu tiên được phân đoạn thành chất xám (GM), chất trắng (WM) và dịch não tủy (CSF) bằng phần mềm Statistical Parametric Mapping (SPM2; http://spm.ion.ucl.ac.uk). Đối với mỗi ROI quang phổ, vị trí của nó được đăng ký vào các hình ảnh cấu trúc được phân đoạn và hàm lượng GM, WM và CSF của ROI được tính toán bằng phần mềm nội bộ. Sau đó, các giá trị chất chuyển hóa tuyệt đối được tính toán từ các đầu ra của LCModel được chia tỷ lệ theo nước thô (phiên bản 6.3-0I;
http://s-provencher.com/lcmodel.shtml) như sau:
Metababsolute ¼ Metabraw
´ðGM þ WM þð1:55 ´CSFÞ=GM þ WMÞ
trong đó GM, WM và CSF cộng lại bằng 1. Thuật ngữ (1,55 × CSF) được đưa vào vì CSF chứa nhiều nước hơn GM hoặc WM, do đó CSF có xu hướng làm giảm ước tính quy mô nước của các chất chuyển hóa, ngoài các hiệu ứng thể tích một phần thông thường11. Ở thể vân, các nhóm không khác nhau về sự đóng góp mô trung bình của GM, WM hoặc CSF như được chỉ ra bởi các kiểm định t hai đuôi không ghép cặp mẫu độc lập (tất cả các giá trị p > 0,44) (kiểm soát:
GM 52,5%, WM 43,3%, CSF 8,4%; ASD: GM 52,4%, WM
Bảng 2 Tóm tắt các đặc điểm về nguyên nhân và hành vi của các mô hình gặm nhấm mắc ASD
Các mô hình gặm nhấm và kiểm soát của chúng n Hành vi xã hội Giao tiếp Hành vi lặp đi lặp lại Tài liệu tham khảo
Chuột được điều trị bằng VPA so với nước muối 8 + 7 USV bị suy yếu Tăng 27
BTBR T+tf/J so với chuột WT C57Bl/6J 15 + 15 USV bị suy yếu Tăng 34
15q11-13 patDp so với chuột WT 10 + 10 USV bị suy yếu Không thay đổi 28–31
Shank3 Chuột KO so với WT 15 + 15 USV bị suy yếu bị thay đổi Tăng 26,32
Nlgn3R451C KI so với WT 15 + 14 USV bị suy yếu bị thay đổi Không thay đổi 25
Nlgn3 KO so với WT chuột 12 + 12 USV bị suy yếu bị thay đổi Tăng 33
Tất cả các mô hình chuột đều có nền tảng C57BL/6J, ngoại trừ chuột VPA (CD1) và BTBR T+tf/J. Mô hình chuột có nền tảng Sprague-Dawley. Các bạn cùng lứa kiểu hoang dã được sử dụng làm đối chứng, ngoại trừ chuột VPA và BTBR T+tf/J trong đó chuột CD1 được xử lý bằng nước muối cùng độ tuổi và chuột C57BL/6J kiểu hoang dã đóng vai trò là đối chứng tương ứng
Rối loạn phổ tự kỷ ASD, KI knock-in, KO knock-out, patDp nhân đôi cha, USV phát âm siêu âm, VPA axit valproic, WT hoang dã loại
43,8% và CSF 8,0%). Trong mPFC, có sự khác biệt đáng kể giữa các nhóm về sự đóng góp của GM, cao hơn ở nhóm ASD (nhóm đối chứng: 57,0%; ASD: 58,7%; p = 0,01; kiểm định t hai đuôi). Sự gia tăng GM có thể phản ánh sự thay đổi giải phẫu thần kinh vỏ não ở nhóm ASD43. Tuy nhiên, vì cấu trúc não không phải là trọng tâm của nghiên cứu hiện tại, nên chúng tôi không cố gắng mô tả thêm sự khác biệt này mà thay vào đó nhập tỷ lệ đóng góp của GM làm biến phụ thuộc trong các so sánh nhóm ở mPFC. Không thấy sự khác biệt nào ở WM (nhóm đối chứng: 25,8%; ASD: 24,3%; p = 0,19; kiểm định t hai đuôi) hoặc sự đóng góp của CSF (nhóm đối chứng: 20,6%; ASD: 20,3%; p = 0,70; kiểm định t hai đuôi).
Mô hình loài gặm nhấm
[1H]Các cuộc điều tra MRS đã được tiến hành trên năm mô hình chuột và một mô hình chuột mắc ASD. Các mô hình chuột bao gồm: chuột được tiếp xúc trước khi sinh với VPA và các đối chứng tiếp xúc với nước muối cùng độ tuổi (Phòng thí nghiệm Harlan, Horst, Hà Lan; nền tảng CD1), chuột BTBR T+tf/J (Phòng thí nghiệm Jackson, Bar Harbor, ME, Hoa Kỳ) và các đối chứng C57BL/6J kiểu hoang dã cùng độ tuổi (Phòng thí nghiệm Jackson, Bar Harbor, ME, Hoa Kỳ), chuột 15q11-13 patDP (do T. Takumi, RIKEN, Wako, Nhật Bản cung cấp; nền tảng di truyền C57BL/6J), chuột Shank3 KO (Phòng thí nghiệm Phòng thí nghiệm Jackson, Bar Harbor, ME, Hoa Kỳ; nền tảng di truyền C57BL/6J), chuột Nlgn3R451C KI (Đại học Rockefeller, NY, Hoa Kỳ; nền tảng di truyền C57BL/6J) và các bạn cùng lứa kiểu hoang dã tương ứng. Ngoài ra, chuột Nlgn3 KO và các bạn cùng lứa kiểu hoang dã của chúng (Horizon Discovery, Boyertown, PA, Hoa Kỳ; nền tảng di truyền SpragueDawley) đã được sử dụng. Tổng quan về các mô hình động vật gặm nhấm và đặc điểm hành vi của chúng được đưa ra trong Bảng 2. Tổng cộng 75 động vật giống ASD và 73 đối chứng tương ứng đã được nghiên cứu trong các nhóm gồm 7–15 động vật trên mỗi điều kiện (Bảng 2). Kích thước mẫu mục tiêu lý tưởng là ≥12 động vật trên mỗi điều kiện dựa trên các đánh giá biến thiên nội bộ trước đó44 và phải giảm vì lý do hậu cần trong một số trường hợp.
Các con vật được chọn ngẫu nhiên từ các lứa khác nhau. Tất cả các con vật đều là con đực trưởng thành từ 12–16 tuần tuổi (tương đương với độ tuổi của những người tham gia nghiên cứu ở người ở loài gặm nhấm)45 và cân nặng, tùy thuộc vào loài và chủng, là 20–50 g (chuột nhắt) và 350–500 g (chuột cống) tại thời điểm nghiên cứu. Các con vật được nuôi theo nhóm (hai đến ba con mỗi lồng) trong môi trường có kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm và ánh sáng (22–24 °C, 40–60%, chu kỳ sáng/tối 12 giờ) và được tiếp cận với thức ăn và nước uống tùy ý. Các thí nghiệm trên động vật đã được Văn phòng Thú y và An toàn Thực phẩm Liên bang Thụy Sĩ chấp thuận (tham chiếu BS-2359 và BS-2523) và được tiến hành theo đúng quy định của liên bang Thụy Sĩ về bảo vệ và phúc lợi động vật, cũng như theo các quy tắc của Hiệp hội Đánh giá và Công nhận Chăm sóc Động vật Thí nghiệm Quốc tế. Gặm nhấm [1H]MRS: thu thập và xử lý dữ liệu
[1H]MRS ở loài gặm nhấm được thực hiện trên máy quét MR động vật nhỏ Biospec 9.4T/ 20 cm nằm ngang (Bruker, Ettlingen, Đức), được trang bị hệ thống hai cuộn dây tách rời chủ động bao gồm một bộ cộng hưởng để kích thích tín hiệu và một cuộn dây bề mặt đầu để thu tín hiệu. Đối với [1H] MRS, ban đầu chuột được gây mê bằng 2,5–3% isoflurane (Abbott, Baar, Thụy Sĩ) trong khí mang gồm oxy và không khí (1:5 v/v) được cung cấp bằng mặt nạ cho con vật thở tự do. Sau đó, etomidate (Etomidate-®Lipuro; B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Đức) được dùng dưới dạng truyền tĩnh mạch liên tục đã mồi theo các quy trình và điều kiện đã báo cáo trước đó45. Chuột được gây mê chỉ bằng isoflurane: nồng độ isoflurane được điều chỉnh trong khoảng từ 2,0 đến 2,3% để duy trì nhịp thở ổn định là 60 nhịp/phút. Động vật được đặt trong nôi được làm riêng và đầu của chúng được cố định trong khung định vị. Nhịp thở, nhiệt độ cơ thể trực tràng và mức CO2 trong không khí thở ra được theo dõi liên tục trong suốt quá trình thí nghiệm như đã mô tả trước đây46,47. Nhiệt độ cơ thể được duy trì ở mức 37 °C bằng chăn sưởi điện được điều chỉnh phản hồi.
Hình ảnh tham chiếu giải phẫu thu được bằng phương pháp thu nhận nhanh với tiếng vang tập trung lại (RARE)48 (TR = 1800 ms, TEeff = 36 ms, hệ số RARE 8, ma trận 256 × 256 trên 20 × 20 mm và 40 × 40 mm cho chuột và chuột cống). Hai ROI tương đồng với những ROI ở người đã được chọn ở thể vân phải và mPFC. Thể vân phải được chọn dựa trên sự thiếu hụt bên hóa chất chuyển hóa được cho là và để đảm bảo khả năng tương thích với các nghiên cứu trước đây của chúng tôi44 và cơ sở dữ liệu nội bộ mở rộng về dữ liệu [1H]MRS ở loài gặm nhấm. ROI bao gồm ~6 µl ở chuột (vân não: 2 × 1,8 × 1,8 mm; mPFC: 1,5 × 2,6 × 1,5 mm) và ~16 µl ở chuột (vân não và mPFC: 2,5 × 2,5 × 2,5 mm). Các ví dụ về vị trí ROI được thể hiện trong Hình bổ sung 2a, b. Độ đồng nhất của từ trường cục bộ được điều chỉnh riêng cho cả hai ROI bằng cách áp dụng Fastmap49. [1H]MRS được thực hiện bằng PRESS, vì từ trường cao 9,4T cho phép phát hiện trực tiếp GABA mà không cần sử dụng các kỹ thuật chỉnh sửa phổ như MEGAPRESS50. Các tham số thu thập là: TR = 2000 ms và TE = 10 ms, độ rộng phổ 4 kHz được lấy mẫu với 2048 điểm dữ liệu phức hợp và 512 giá trị trung bình được thu thập trong hơn 17 phút. Trình tự PRESS đã được sửa đổi sao cho tần số của các xung kích thích (hình dạng hermite 1,35 ms, băng thông 4 kHz) và xung hội tụ lại (hình dạng hermite 1,2 ms, băng thông 2,85 kHz) được dịch chuyển 2 ppm lên phía trên nước để giảm thiểu sự dịch chuyển hóa học trong quá trình lựa chọn thể tích cho phạm vi chất chuyển hóa quan tâm. Việc ức chế nước được thực hiện bằng cách sử dụng một loạt các xung tần số vô tuyến công suất thay đổi trên cộng hưởng nước51, xen kẽ với việc ức chế thể tích bên ngoài bằng các xung đoạn nhiệt (khoảng cách 1 mm đến ROI, các tấm bão hòa 5 mm). Một phổ nước không bị ức chế đã thu được ngay trước mỗi lần thu thập phổ chất chuyển hóa bằng cách sử dụng các tham số thu thập giống hệt nhau nhưng chỉ có tám giá trị trung bình52. Phân tích định lượng dữ liệu [1H]MRS đã được thực hiện bằng phần mềm LCModel (phiên bản 6.3-0D) trong một đường ống hoàn toàn tự động. Bộ cơ sở bao gồm các phổ mô hình cho 17 chất chuyển hóa và tám thành phần đại phân tử/lipid. Nồng độ chất chuyển hóa tuyệt đối đã được xác định theo tham chiếu đến nước không bị ức chế, không hiệu chỉnh để thư giãn. Các phép đo phổ được xem xét trực quan để xác minh rằng phổ là bình thường về mặt định tính. Chất lượng của phổ [1H]MRS thu được được thể hiện trong Hình bổ sung 2a,b. Tiêu chí loại trừ được xác định trước bao gồm tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu kém (năm hoặc thấp hơn) và chuyển động đầu được phát hiện trong quá trình thu thập dữ liệu. Hơn nữa, các ước tính glutamine đã bị loại trừ khi chúng vượt quá 3,5 mM (giá trị này đại diện cho ngưỡng theo kinh nghiệm nội bộ của chúng tôi phân tách các đối tượng có mức glutamine cao bất thường53 với các đối tượng có mức glutamine bình thường). Chỉ có tiêu chí sau dẫn đến việc loại trừ các điểm dữ liệu, cụ thể là mười ước tính glutamine từ mPFC và vân não của năm động vật. Mặc dù không có sự che giấu nào đối với kiểu gen/chủng của động vật trong quá trình thu thập dữ liệu, xử lý hoặc phân tích thống kê, toàn bộ quy trình được tự động hóa hoàn toàn và ngoài việc kiểm tra trực quan các quang phổ, không có bước nào có nguy cơ gây ra sai lệch cho người dùng